Ca2+离子调控的植物Metacaspase4的分子激活机制

细胞程序性死亡普遍存在于植物发育、外界胁迫和损伤引起的免疫反应或抵抗病原体攻击的过程中，该进程受到植物Metacaspase4的参与和调控。植物Metacaspase4的激活及催化机制均需要Ca2+离子的参与。植物受到物理性损伤时，受Ca2+离子调控的Metacaspase4会被激活并剪切PROPEP1释放免疫调节肽Pep1，从而引起周围组织的伤口免疫防御反应。在拟兰芥中低浓度Ca2+离子条件下，Metacaspase4和PROPEP1均在细胞质中保持无活性状态，直到细胞受损后其细胞质膜完整性丧失，导致胞内Ca2+离子浓度持续增加。Metacaspase4与Ca2+离子结合后首先启动自剪切，此后剪切PROPEP1产生Pep1，Pep1从液泡膜膜上释放到细胞质中，通过被动扩散或受损的质膜主动外排向周围完整的细胞发出紧急免疫信号。但在此过程中，受Ca2+离子调控的Metacaspase4的分子激活机制依尚未清楚。

2020年5月7日，美国布鲁克海文国家实验室Qun Liu教授和朱萍博士等人在Nature Communications上在线发表了题为“Structural basis for Ca2+-dependent activation of a plant metacaspase”的研究论文，解析了拟南芥II型Metacaspase4（AtMC4）多个不同状态的晶体结构，首次揭示了在Ca2+介导下的II型Metacaspase4调控损伤诱导型植物免疫防御的分子激活机制。

AtMC4结构的解析

该研究中AtMC4蛋白不仅没有同源结构，并且在不同状态下的晶体均为多晶。首先通过表达硒代蛋白用以确定相位，并利用单波长反常散射SIRAS方法首先解析了无活性的AtMC4-C139A突变型蛋白的“an open book”晶型的晶体结构，分辨率为2.8Å。其次通过分子置换方法解析了极容易“老化”的活性野生型AtMC4的“Needle cluster” 晶型的晶体结构,分辨率为3.48Å。然后运用自主开发的微晶结构解析法解析了Ca2+激活后的野生型AtMC4晶体结构，分辨率为3.2Å。成功捕获AtMC4的失活态、中间态等多个结构状态。

AtMC4自我抑制的分子机制

晶体结构显示AtMC4的Linker结构域是个全新的结构参与活性中心的结合，其N端穿过高度保守的活性中心表面，将K225残基插入带负电的活性口袋中。Linker结构域与活性中心通过主链原子相互作用。该结构有力地展示了AtMC4的自我抑制状态。

Ca2+离子调控的AtMC4的自剪切和激活的分子机制

晶体结构显示镧系Sm3+离子与Linker结构域相互作用的p20结构域上的L5环上的D98紧密结合，基本可以认为D98是Ca2+离子的结合位点，L5环在Ca2+激活AtMC4中的发挥重要作用。Ca2+激活后的野生型AtMC4的Linker结构域N端电子云密度消失，K225残基发生第一步自剪切。生化分析表面Linker-N区域R180、R190、K210进一步自剪切，破坏β11-β12发夹的稳定性，形成无序的L3环。随后Linker-C区域α螺旋上的K237和K267进一步剪切，破坏Linker-C区域螺旋结构和L5环，与L3环形成环束。这一环束可能通过诱导拟合机制在底物剪切中起重要作用。

损伤诱导AtMC4的底物剪切分子机制

体外生化分析显示L5环上Ca2+离子的结合位点氨基酸的突变导致AtMC4无法剪切PROPEP1释放Pep1。体内损伤分析显示了相同的结论。体外生化显示Linker结构域K237和K267位点的突变导致在剪切PROPEP1释放Pep1过程中对Ca2+离子更加敏感，这可能是由于突变使Linker结构域更加灵活从而与L5环的静电相互作用减弱。体内损伤分析显示K237和K267位点的突变使AtMC4剪切PROPEP1能力增强，这可能是这两个位点对AtMC4底物剪切的负调控作用。这一现象值得将来进一步研究。

美国布鲁克海文国家实验室结构生物学课题组Qun Liu教授、植物分子生化研究课题组John Shanklin教授和新泽西州立大学植物分子生化研究课题组Eric Lam 教授为本文共同通讯作者。美国布鲁克海文国家实验室朱萍博士为本文第一作者，美国布鲁克海文国家实验室Xiaohong Yu博士为本文共同第一作者。朱萍博士现已回国参加工作，博士毕业于南京工业大学。